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細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：從計(jì)數(shù)板到全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

許多常見的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)需要科學(xué)家首先準(zhǔn)確計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量或密度。這些操作包括簡單的細(xì)胞培養(yǎng)維護(hù)（如細(xì)胞傳代）以及定量實(shí)驗(yàn)（如qPCR）。細(xì)胞計(jì)數(shù)可以通過多種方法完成，本文將全面介紹這些方法及其優(yōu)缺點(diǎn)。

1 計(jì)數(shù)板/血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器時(shí)，首先用70%酒精和鏡頭紙清潔計(jì)數(shù)器，然后將蓋玻片輕輕放置在計(jì)數(shù)板上。如果正確放置蓋玻片，可以觀察到牛頓環(huán)現(xiàn)象（同心環(huán)狀的彩色圖案）。用移液器取一小部分細(xì)胞懸液，將移液器放在計(jì)數(shù)板邊緣，讓懸液通過毛細(xì)作用流入計(jì)數(shù)室。如果需要檢測(cè)細(xì)胞活性，應(yīng)在加入計(jì)數(shù)室前將臺(tái)盼藍(lán)以1:1比例混入細(xì)胞懸液中。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器是最早專門用于獲取準(zhǔn)確細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，計(jì)數(shù)板上有特殊的網(wǎng)格。通常，大方格為1毫米×1毫米，并被進(jìn)一步分為0.05毫米×0.05毫米的小格子。計(jì)數(shù)室的邊緣設(shè)計(jì)為將蓋玻片固定在標(biāo)記網(wǎng)格上方0.1毫米處，從而形成已知體積的區(qū)域。

顯微鏡聚焦到計(jì)數(shù)室的一個(gè)區(qū)域后，使用計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常采用1平方毫米（100納升）的區(qū)域，并使用4倍或10倍物鏡計(jì)數(shù)，但具體選擇取決于細(xì)胞大小和懸液中的密度。此過程通常會(huì)在四個(gè)不同的1平方毫米區(qū)域重復(fù)，結(jié)果取平均值。如果檢測(cè)細(xì)胞活性，應(yīng)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，其中由于膜受損，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染色為藍(lán)色。

圖1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板網(wǎng)格的示意圖

優(yōu)缺點(diǎn)

手動(dòng)計(jì)數(shù)是節(jié)約預(yù)算的方法，但也是最耗時(shí)且繁瑣的。由于人為誤差，特別是連續(xù)進(jìn)行多次計(jì)數(shù)時(shí)，可靠性較低。此外，頻繁計(jì)數(shù)還可能導(dǎo)致眼部疲勞。如果實(shí)驗(yàn)室只需偶爾計(jì)數(shù)，并且不需要高精度，那么血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。但在需要頻繁計(jì)數(shù)、提高精度或高通量應(yīng)用時(shí)，這種方法顯得不足。此外，手動(dòng)計(jì)數(shù)難以區(qū)分懸液中不同類型的細(xì)胞，除非細(xì)胞類型在大小或形狀上有顯著差異。

2 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是手動(dòng)計(jì)數(shù)的快速、簡便且自動(dòng)化的替代方案。它們基于與血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相同的原理，通過在已知區(qū)域內(nèi)多次計(jì)數(shù)細(xì)胞并取平均值來完成操作。這些設(shè)備也能通過臺(tái)盼藍(lán)等染料排除法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以是獨(dú)立設(shè)備，也可以連接到計(jì)算機(jī)使用。大多數(shù)計(jì)數(shù)儀除了提供細(xì)胞計(jì)數(shù)外，還能統(tǒng)計(jì)細(xì)胞大小等信息。

熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（例如 Luna-FL™ 雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并使用常見的染色劑（例如吖啶橙和碘化丙啶）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。這些類型的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在計(jì)數(shù)可能被非細(xì)胞碎片（例如原代細(xì)胞）污染的培養(yǎng)物中的細(xì)胞方面也表現(xiàn)出色，因?yàn)槿玖峡梢郧宄貐^(qū)分細(xì)胞。

優(yōu)缺點(diǎn)

自動(dòng)計(jì)數(shù)儀適合通用的細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)。它操作簡單、成本較低，大大減少了手動(dòng)計(jì)數(shù)的勞動(dòng)量。自動(dòng)計(jì)數(shù)儀精確可靠，但在計(jì)數(shù)形狀不規(guī)則、非常小、懸液極為稀薄或包含多種需要區(qū)分的細(xì)胞時(shí)可能存在挑戰(zhàn)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型和應(yīng)用，自動(dòng)計(jì)數(shù)儀提供了高效的計(jì)數(shù)性能。

3 Coulter計(jì)數(shù)儀

Coulter計(jì)數(shù)儀并非光學(xué)儀器，而是通過測(cè)量微通道的電阻變化來計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞的電阻高于懸液電解質(zhì)溶液，當(dāng)細(xì)胞通過通道時(shí)會(huì)短暫增加電阻，這一變化隨細(xì)胞大小增加而增大。Coulter計(jì)數(shù)儀的操作類似于自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，但使用前需先運(yùn)行空白測(cè)試，并在使用后進(jìn)行設(shè)備沖洗。

優(yōu)缺點(diǎn)

庫爾特計(jì)數(shù)儀速度快，能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)不同大小的細(xì)胞，因此常用于醫(yī)院的血細(xì)胞計(jì)數(shù)。然而，它無法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，也無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)形成團(tuán)簇的細(xì)胞。此外，其維護(hù)要求較高。

4 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀通常用于更詳細(xì)的細(xì)胞分析，配備熒光檢測(cè)技術(shù)，可檢測(cè)標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)成分。并非所有流式細(xì)胞儀都能進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，但具備體積測(cè)量功能的流式細(xì)胞儀可提供高度準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并可通過熒光標(biāo)記的抗體區(qū)分細(xì)胞類型。

優(yōu)缺點(diǎn)

流式細(xì)胞儀功能強(qiáng)大，但價(jià)格昂貴，通常在$40,000至$100,000以上，因此很少用于常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5 其他細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

光譜測(cè)定偶爾用于估算細(xì)胞密度。由于細(xì)胞具有渾濁性，隨著細(xì)胞密度增加，透過比色皿的光線減少。然而，由于光譜儀并未直接計(jì)數(shù)細(xì)胞，僅測(cè)量吸光度，并且懸液中其他變量可能影響吸光度，因此這種方法并不可靠。

培養(yǎng)法是另一種計(jì)數(shù)方法，僅適用于形成菌落的細(xì)胞（如細(xì)菌）。細(xì)胞懸液經(jīng)過稀釋并劃線至培養(yǎng)皿后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)目以計(jì)算原始懸液的細(xì)胞密度。但由于需要等待菌落生長，培養(yǎng)法是最慢的方法。

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：更精準(zhǔn)的計(jì)數(shù)帶來更優(yōu)質(zhì)的科學(xué)

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